Stbl4電轉感受態細胞

Stbl4電轉感受態細胞

產品規格CAT#: BFNC86041-01(5×50ul)/BFNC86041-02(20×50ul)

Stbl4 Electroporation-Competent Cell                   50μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                                10μl

保存條件(保質期)：                                         -80℃（6個月）

基因型

F′ proAB+ lacIqZ?M15 Tn10 (Tet^R)mcrA ?(mcrBC-hsdRMS-mrr) recA1 endA1 gyrA96 gal- thi-1 supE44 λ- relA1?(lac-proAB)

產品說明

Stbl4菌株來源于 Stbl2 E. coli strain，可用于慢病毒載體或逆轉錄病毒載體的構建。Stbl4菌株適合克隆不穩定插入片段 (正向重復序列，逆轉錄病毒序列等)；mcrA突變和mcrBC-hsd RMS-mrr deletion 使該菌株更適于克隆甲基化的基因組序列。recA 1和endA1的突變有利于克隆DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。lacI^qZΔM15標記使得Stbl4菌株可用于藍、白斑篩選，此菌株具有四環素抗性。

青旗生物生產的Stbl4電轉感受態細胞經特殊工藝制作，pUC19質粒檢測轉化效率可達0.5×10¹⁰ cfu/μg DNA，特別適合于慢病毒質粒文庫或逆轉錄質粒文庫的構建。

Stbl4電轉感受態細胞

操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，待乙醇揮發干凈立即插入冰中，壓實冰面，電擊杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的Stbl4電擊感受態細胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的DNA (質粒或連接產物)并用手bo打EP管底輕輕混勻，避免產生氣泡，立即插入冰中。

      A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19；

      B. 對于連接產物，大部分公司的T4連接酶反應體系或50度反應重組體系可與Stbl4電擊感受態混合后電擊轉化，無需            進行DNA純化，但DNA濃度不能過高，DNA濃度不超過100 ng/μl，體積不超過5 μl/50 μl感受態。

      C. 對鹽濃度較高的DNA溶液或反應體系請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM                  EDTA)重懸，然后與Stbl4電擊感受態混合進行電擊轉化。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產生氣泡，蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數，也可按所用電轉儀推薦的參數操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養基（室溫），用1ml 槍吹吸電擊杯底部數次混勻后，轉移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中補加S.O.C. 培養基至10 ml。30℃，225 rpm復蘇90分鐘。當質粒中含有不穩定片段時，30℃培養可降低錯誤重組的概率，若轉化control pUC19計算轉化效率，則需37℃，225 rpm復蘇60分鐘

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的LB平板上（因菌量較大，若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個）。將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養17-20小時或30℃培養箱過夜培養20-24小時。若轉化control pUC19計算轉化效率，則需37℃培養過夜。

7.若要獲得大量，高純度質粒，建議在TB培養基中30度搖菌培養（以標準質粒PUC19為例：500ml三角瓶中加入100ml TB營養液，經30度250rpm搖菌，可提取約100-200ug PUC19質粒）

S.O.C 培養基配方      

    2% Tryptone                          

1.2%     Tryptone

2.4% Yeast Extract

4%        甘油

17mM   KH2PO4

72mM   K2HPO4

TB培養基配方              

1.2%     Tryptone

2.4% Yeast Extract

4%        甘油

17mM   KH2PO4

72mM   K2HPO4

配制方法（1L）：1，配制磷酸緩沖液（0.17M  KH2PO4, 0.72M  K2HPO4）：

溶解2.31g KH2PO4和 12.54g K2HPO4于90ml去離子水中，定容到100ml，高壓滅菌。2，在燒杯中加入以下試劑：Tryptone  12g， Yeast Extract  24g，甘油 4ml；加入去離子水800ml,充分溶解后，定容至900ml，高壓滅菌。待溶液冷卻至60度以下，加入100ml 滅菌磷酸鹽緩沖液。

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).

注意事項

1. Stbl4電擊感受只能電擊轉化，不可用熱激方法轉化。加入DNA時體積不應大于感受態體積的1/10。

2. 電轉感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡，氣泡會增加弧光放電風險。

3. 當DNA不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時，轉化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導，增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

5. 若轉化大質粒或想獲得較高轉化效率，推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。

6. 對于連接產物轉化，部分公司的連接體系或重組體系(例如：Thermo，NEB公司的T4 連接酶系統，NEB，天根的50度反應重組系統)可以直接與Stbl4電擊感受態混合后電擊轉化，無需純化，但DNA濃度不能過高，盡量不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率，增加弧光放電的風險。

7. 混入質粒時應輕柔操作，吸取感受態細胞時避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細胞膜，降低轉化效率。轉化高濃度的質粒或連接產物可相應減少終用于涂板的菌量。

8. 電轉感受態細胞盡量保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。